L’evoluzione della diagnosi in genetica tra tecnologie e...

Il percorso diagnostico delle malattie genetiche può richiedere molto tempo, poiché può prevedere un lungo iter di visite, esami e diversi test genetici spesso non conclusivi. Attualmente la diagnosi si basa sull’utilizzo a cascata di diverse tecniche complementari tra loro, che permettono di rilevare diversi tipi di alterazioni genomiche.

La scelta del test genetico da eseguire è basata sulle caratteristiche cliniche del paziente, raccolte durante la visita genetica, e sull’ipotesi diagnostica formulata. A fronte di un fenotipo clinico specifico causato da alterazioni di un singolo gene, la scelta del test è orientata verso un’analisi focused che permette l’indagine di un preciso target genetico ad un costo contenuto. Al contrario, con un’indicazione clinica generica ed aspecifica come per condizioni ad elevata eterogeneità genetica, un approccio wide è il più indicato.

L’iter diagnostico impatta in modo incisivo sui tempi di raggiungimento di una diagnosi. Spesso, infatti, alcuni pazienti vanno incontro alla cosiddetta “odissea diagnostica” poiché vengono sottoposti a diversi test non conclusivi che, in alcuni casi, portano addirittura a misdiagnosis, fonte di ulteriori disagi per pazienti e famiglie (Fig. 1).

Tecnologie disponibili e criteri di scelta

L’armamentario diagnostico disponibile oggi è vasto e spesso è difficile orientarsi (Tab. 1).

Le varie tecnologie si distinguono sulla base dell’indicazione clinica (focused o wide), del tipo di riarrangiamento da indagare (variazioni del numero di copie, CNV; varianti strutturali, SV; varianti a singolo nucleotide, SNV), della risoluzione del test (dalla singola base a megabasi) e dei costi (Fig. 2).

Tra le tecniche wide la visione tridimensionale del genoma e quindi la valutazione morfologica dei cromosomi è garantita solo dal cariotipo, tecnica citogenetica tradizionale wide ma a bassa risoluzione, non ancora superata.

L’array-CGH consente l’identificazione di CNV ma non di SV o SNV. L’Optical Genome Mapping, di recente introduzione, fornisce una mappa fisica del DNA grazie alla presenza di tag lungo tutto il genoma, e permette l’identificazione di CNV e SV con una risoluzione maggiore del cariotipo e dell’array-CGH. Il principale limite di questa metodica risiede nella difficoltà di analizzare le regioni ripetute del genoma.

NGS e WGS: la rivoluzione del sequenziamento

L’avvento della next generation sequencing (NGS) ha rivoluzionato la genetica medica, permettendo di sequenziare contemporaneamente un gran numero di geni con l’impiego di pannelli multigenici, fino all’intero esoma (WES) e genoma (WGS).

Oggi il WGS short-reads è la tecnica wide d’elezione: garantendo uniformità di coverage in tutte le regioni genomiche, permette di identificare diversi tipi di alterazioni, da SNV a CNV e SV, seppur con costi apparentemente elevati.

L’analisi del trio probando-genitori, basata sul modello di ereditarietà sospettato e guidata dal fenotipo del paziente, rappresenta l’approccio più efficace per raggiungere rapidamente una diagnosi, con una detection rate che supera il 60% tra i pazienti ricoverati nelle terapie intensive neonatali e pediatriche con sospetta malattia rara.

L’analisi di grossi pannelli multigenici o addirittura di WES e WGS solo sul probando non consente di filtrare e interpretare correttamente il dato, portando all’identificazione di tante varianti a significato incerto che non hanno nessuna utilità per il paziente e anzi, spesso, creano notevoli difficoltà di gestione.

Anche per il WGS short-reads un grosso limite è rappresentato dalle regioni ripetute. Il futuro ormai prossimo della diagnostica genetica è il sequenziamento del genoma long-reads, che consente di caratterizzare anche complessi riarrangiamenti genomici e short tandem repeats, superando i limiti delle short-reads.

Questo strumento sarà in grado di fornire nuove diagnosi in tempi notevolmente ridotti e costi sovrapponibili.

Verso una diagnostica integrata e di precisione

Con le tecnologie oggi disponibili è possibile identificare un numero sempre maggiore di alterazioni sconosciute, non sempre facilmente interpretabili o correlabili al quesito clinico. Per questo in un laboratorio diagnostico dovrebbero essere accessibili strumenti ortogonali all’analisi del genoma, come l’analisi del trascrittoma o del profilo di metilazione del DNA (episignature), che permettono la validazione di alterazioni attraverso approfondimenti funzionali e caratterizzazioni specifiche.

È evidente come il confine tra diagnostica e ricerca si stia assottigliando giorno dopo giorno e quanto la cooperazione tra le due realtà sia indispensabile per il raggiungimento di una diagnosi di malattia rara. Il progresso nella ricerca determina un continuo avanzamento tecnologico che consente nuove conoscenze cliniche e biologiche, ed è su queste fondamenta che si deve appoggiare la diagnostica per fornire sempre più risposte conclusive e accurate.

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